牙髓中存在具备自我更新和多向分化潜能的牙髓干细胞。这些细胞经诱导可向成牙本质
细胞分化并形成牙本质样结构,有望成为牙本质再生的种子细胞。本文就牙髓干细胞的来源、
生物学特性及其在牙本质再生中的应用作一综述
当受到深龋、穿髓等重度损伤导致成牙本质
细胞死亡后,牙髓组织中的前体细胞分化为成牙
本质细胞并形成修复性牙本质。2000 年Gronthos
等[1]首先提出成人牙髓中存在具备自我更新和多
向分化潜能的前体细胞―――牙髓干细胞( dental
pulp stem cells, DPSCs)。DPSCs 经诱导可向成牙
本质细胞分化并形成牙本质样结构[2],预示了其
在牙本质再生中作为种子细胞的应用前景。1 牙髓干细胞的来源
2000 年Gronthos 等[1]从19―29 岁成人阻生第
三磨牙的牙髓中分离到DPSCs。Miura 等[3]发现人
脱落乳牙的牙髓中亦含有多能干细胞( stem cells
from human exfoliated deciduous teeth, SHED)。
SHED与DPSCs 一样,具有高度增殖和克隆形成
的特性,将体外扩增的DPSCs 和SHED 与羟磷灰
石/磷酸三钙( hydroxyapatite/tricalcium phosphate,
HA/TCP)联合植入免疫抑制小鼠的皮下均可形成
牙本质- 牙髓样结构[4]。与DPSCs 不同的是,SHED
的增殖能力比DPSCs 强,并可诱导小鼠细胞向骨
形成细胞分化[3],提示SHED 与DPSCs 在成骨诱
导的性状上是有差异的。虽然两者性状有所不同,
但是DPSCs 与SHED 均表达STRO- 1 和CD146 这
两种早期间充质干细胞的表面标志[3]。在人牙髓组织中,STRO- 1 主要定位于血管壁和神经束膜,
CD146 定位于牙髓的微血管,而STRO- 1 和CD146
的共表达仅限于血管外壁,因此推测DPSCs 与
SHED来源于血管周的微环境( perivascular niche)[5],
对于两者是同一种细胞的不同分化阶段,还是两
种不同的细胞尚不清楚。2 牙髓干细胞的生物学特性
2.1 牙髓干细胞的形态
DPSCs 在形态上类似人骨髓成纤维细胞集落形
成单位( colony forming unit fibroblast, CFU- F)[1],
大多数细胞呈长梭形,体积较小。透射电镜下,
DPSCs 的核呈卵圆形,约占胞体体积的80%―
90%,核仁大而明显,常染色质居中,异染色质
少,分布于核周。胞浆很少,核浆比例大。细胞器
较少,核糖体丰富[6]。这些形态特征体现了DPSCs
的未分化或低分化状态。
2.2 牙髓干细胞集落形成与增殖率
同样的接种密度,骨髓细胞悬液中CFU- F 的
频率为每万个细胞有2.4―3.1 个集落,而牙髓细
胞悬液中CFU- F 的频率为每万个细胞有22―70
个集落,说明成人牙髓细胞具有较高的集落形成
能力,并推测牙髓组织中干细胞的含量可能高于
骨髓组织。采用溴脱氧尿嘧啶核苷掺入法( bromodeoxyuridine
incorporation,BrdU)比较第1 代DPSCs
和骨髓基质细胞( bone marrowstromal cells,
BMSCs)的增殖率, 发现DPSCs 培养物中约有72%
BrdU阳性细胞,而BMSCs 培养物中的BrdU 阳性细胞约为46%,表明体外培养的DPSCs 的增殖率
高于BMSCs2.3 牙髓干细胞的自我更新
自我更新是干细胞的重要特性。从人DPSCs
与HA/TCP 复合移植物所形成的牙本质- 牙髓样结
构中,分离其中的基质样细胞( stromal- like cells)
发现,人源性细胞占85%,将这些细胞扩增后再
度与HA/TCP 复合植入动物皮下后又形成牙本质-
牙髓样结构,其中的成牙本质细胞表达人类特异
性alu 基因,牙本质呈人类牙本质涎蛋白( dentin
sialoprotein,DSP)阳性,从而证实DPSCs 具有自
我更新的能力[2]。2.4 牙髓干细胞的多向分化
在不同的微环境作用下,DPSCs 可分化为多
种细胞。矿化诱导培养基中,DPSCs 能够形成与
前期牙本质相似的球状矿化基质并表达成牙本质
细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白( dentin sialophosphoprotein,
DSPP)[2];在脂肪诱导培养基中,
DPSCs 培养物中出现油红O 阳性的脂滴,并伴随
脂肪细胞特异性的pparγ2 和lpl 基因表达上调;
此外,DPSCs 还在mRNA 和蛋白水平表达神经前
体细胞和神经胶质细胞的标志―――神经巢蛋白
( nestin)和神经胶质纤维酸性蛋白( glial fibrillary
acid protein,GFAP),这说明体外培养的DPSCs
有向神经样细胞分化的潜能[2]。国内学者也成功
的诱导了DPSCs 向成牙本质细胞、肌管样细胞以
及脂肪细胞的分化[7- 8]。由此可见DPSCs 具备干细
胞的另一重要特性,即多向分化潜能,其分化受
周围微环境的影响3 牙髓干细胞与牙本质再生
3.1 牙髓干细胞的激活和迁移
修复性牙本质的形成是一个复杂的生物学过
程,其中包括牙髓干/祖细胞的增殖、迁移和向成
牙本质细胞样细胞的分化,最终在受损伤的部位
形成修复性牙本质[9- 11]。目前对牙髓中存在干/祖
细胞的观点已得到公认,但是关于这些干/祖细胞
在牙髓受到损伤后如何激活并迁移到受损部位的
报道甚少。Mathieu 等[12]将绿色荧光蛋白标记的人
牙髓成纤维细胞( human dental pulp fibroblast,
HDPF)培养在含滤膜培养基的上方,红色荧光蛋
白- 2 标记的人脐静脉内皮细胞( human umbilical
vein endothelial cell,HUVEC)培养在滤膜下方,
用无菌刀片造成HUVEC 的机械性损伤后,倒倒置
荧光显微镜下观察细胞自上而下的迁移,结果发
现HDPF 移向HUVEC,并由在HUVEC 层的随机
分布逐渐聚集在受损部位,未受损的HUVEC 不
能诱导HDPF 的迁移,说明内皮细胞的损伤参与
了HDPF 的迁移。为进一步探讨牙髓干/祖细胞对
成牙本质细胞损伤的反应,研究人员又在新鲜拔
除的根尖未发育完成的人第三磨牙上制备浅窝洞
或开髓,将牙齿置于含BrdU 的最低基础培养基
( minimum essential medium,MEM) 中培养1 d后,
转入不含BrdU 的MEM继续培养4 周,对牙齿标
本进行苏木素- 伊红( hematoxylin- erosin,HE)染
色和抗BrdU 的免疫组化染色。第1 天,BrdU标记
细胞位于血管周的细胞核内,2 周后BrdU 标记细
胞离开血管,4周后聚集在窝洞部位。未行窝洞
制备或未露髓的牙齿没有观察到BrdU 标记细胞,
表明成牙本质细胞的损伤将刺激血管周的牙髓干/
祖细胞增殖并向受损部位迁移[13]。
3.2 修复性牙本质的再生
众多研究表明,成牙本质细胞分化以及牙本
质的修复与再生是多种生长因子、细胞外基质分
子网络调控的结果。其中骨形成蛋白( bone morphogenetic
protein,BMP)和转化生长因子- β ( transforming
growth factor- β,TGF- β)在许多重要环节
起关键性作用,包括细胞的增殖、分化、迁移、
粘附、凋亡以及细胞外基质的形成[14- 16]。
有学者将猪牙髓组织经酶消化后,离心使之
形成三维球形细胞团( pellet culture),广州兄弟搬家,加入一定
浓度的BMP2 体外继续培养,发现通过细胞之间
的直接接触和相互作用,细胞形成的胞外基质作
为天然支架,球形细胞团形成了大量的骨性牙本
质,BMP2 对球形细胞团中干细胞的促分化效应
明显强于单层培养的干细胞;进一步将经BMP2
处理的自体牙髓细胞球形团移植到活髓切断的狗
牙牙髓,髓腔中形成的修复性牙本质的厚度超
过未经BMP2 处理的对照组[17]。Nakashima 等[18]
用电穿孔技术将转化生长因子11 的gdf 11 基因导
入DPSCs, 转染细胞的碱性磷酸酶( alkalin
p hosphatase,ALP)、牙本质基质蛋白- 1 ( dentin
matrix protein- 1,DMP- 1)、DSPP 等表达较对照组
增加,将转染的DPSCs 移植到自体牙髓组织中,
形成修复性牙本质。这表明gdf 11 促进了DPSCs
向成牙本质细胞的分化。这些研究结果一方面说
明DPSCs 与生长因子复合能够显著促进牙髓损伤
的修复和重建,另一方面也表明干细胞治疗可望v倒置
荧光显微镜下观察细胞自上而下的迁移,结果发
现HDPF 移向HUVEC,并由在HUVEC 层的随机
分布逐渐聚集在受损部位,未受损的HUVEC 不
能诱导HDPF 的迁移,说明内皮细胞的损伤参与
了HDPF 的迁移。为进一步探讨牙髓干/祖细胞对
成牙本质细胞损伤的反应,研究人员又在新鲜拔
除的根尖未发育完成的人第三磨牙上制备浅窝洞
或开髓,将牙齿置于含BrdU 的最低基础培养基
( minimum essential medium,MEM) 中培养1 d后,
转入不含BrdU 的MEM继续培养4 周,对牙齿标
本进行苏木素- 伊红( hematoxylin- erosin,HE)染
色和抗BrdU 的免疫组化染色。第1 天,BrdU标记
细胞位于血管周的细胞核内,2 周后BrdU 标记细
胞离开血管,4周后聚集在窝洞部位。未行窝洞
制备或未露髓的牙齿没有观察到BrdU 标记细胞,
表明成牙本质细胞的损伤将刺激血管周的牙髓干/
祖细胞增殖并向受损部位迁移[13]。
3.2 修复性牙本质的再生
众多研究表明,成牙本质细胞分化以及牙本
质的修复与再生是多种生长因子、细胞外基质分
子网络调控的结果。其中骨形成蛋白( bone morphogenetic
protein,BMP)和转化生长因子- β ( transforming
growth factor- β,TGF- β)在许多重要环节
起关键性作用,包括细胞的增殖、分化、迁移、
粘附、凋亡以及细胞外基质的形成[14- 16]。
有学者将猪牙髓组织经酶消化后,离心使之
形成三维球形细胞团( pellet culture),加入一定
浓度的BMP2 体外继续培养,发现通过细胞之间
的直接接触和相互作用,细胞形成的胞外基质作
为天然支架,球形细胞团形成了大量的骨性牙本
质,BMP2 对球形细胞团中干细胞的促分化效应
明显强于单层培养的干细胞;进一步将经BMP2
处理的自体牙髓细胞球形团移植到活髓切断的狗
牙牙髓,髓腔中形成的修复性牙本质的厚度超
过未经BMP2 处理的对照组[17]。Nakashima 等[18]
用电穿孔技术将转化生长因子11 的gdf 11 基因导
入DPSCs, 转染细胞的碱性磷酸酶( alkalin
p hosphatase,ALP)、牙本质基质蛋白- 1 ( dentin
matrix protein- 1,DMP- 1)、DSPP 等表达较对照组
增加,将转染的DPSCs 移植到自体牙髓组织中,
形成修复性牙本质。这表明gdf 11 促进了DPSCs
向成牙本质细胞的分化。这些研究结果一方面说
明DPSCs 与生长因子复合能够显著促进牙髓损伤
的修复和重建,另一方面也表明干细胞治疗可望倒置
荧光显微镜下观察细胞自上而下的迁移,结果发
现HDPF 移向HUVEC,并由在HUVEC 层的随机
分布逐渐聚集在受损部位,未受损的HUVEC 不
能诱导HDPF 的迁移,说明内皮细胞的损伤参与
了HDPF 的迁移。为进一步探讨牙髓干/祖细胞对
成牙本质细胞损伤的反应,研究人员又在新鲜拔
除的根尖未发育完成的人第三磨牙上制备浅窝洞
或开髓,将牙齿置于含BrdU 的最低基础培养基
( minimum essential medium,MEM) 中培养1 d后,
转入不含BrdU 的MEM继续培养4 周,对牙齿标
本进行苏木素- 伊红( hematoxylin- erosin,HE)染
色和抗BrdU 的免疫组化染色。第1 天,BrdU标记
细胞位于血管周的细胞核内,2 周后BrdU 标记细
胞离开血管,4周后聚集在窝洞部位。未行窝洞
制备或未露髓的牙齿没有观察到BrdU 标记细胞,
表明成牙本质细胞的损伤将刺激血管周的牙髓干/
祖细胞增殖并向受损部位迁移[13]。
3.2 修复性牙本质的再生
众多研究表明,成牙本质细胞分化以及牙本
质的修复与再生是多种生长因子、细胞外基质分
子网络调控的结果。其中骨形成蛋白( bone morphogenetic
protein,BMP)和转化生长因子- β ( transforming
growth factor- β,TGF- β)在许多重要环节
起关键性作用,包括细胞的增殖、分化、迁移、
粘附、凋亡以及细胞外基质的形成[14- 16]。
有学者将猪牙髓组织经酶消化后,离心使之
形成三维球形细胞团( pellet culture),加入一定
浓度的BMP2 体外继续培养,发现通过细胞之间
的直接接触和相互作用,细胞形成的胞外基质作
为天然支架,球形细胞团形成了大量的骨性牙本
质,BMP2 对球形细胞团中干细胞的促分化效应
明显强于单层培养的干细胞;进一步将经BMP2
处理的自体牙髓细胞球形团移植到活髓切断的狗
牙牙髓,髓腔中形成的修复性牙本质的厚度超
过未经BMP2 处理的对照组[17]。Nakashima 等[18]
用电穿孔技术将转化生长因子11 的gdf 11 基因导
入DPSCs, 转染细胞的碱性磷酸酶( alkalin
p hosphatase,ALP)、牙本质基质蛋白- 1 ( dentin
matrix protein- 1,DMP- 1)、DSPP 等表达较对照组
增加,将转染的DPSCs 移植到自体牙髓组织中,
形成修复性牙本质。这表明gdf 11 促进了DPSCs
向成牙本质细胞的分化。这些研究结果一方面说
明DPSCs 与生长因子复合能够显著促进牙髓损伤
的修复和重建,另一方面也表明干细胞治疗可望为修复性牙本质的再生和活髓保存提供新途径。
3.3 牙本质- 牙髓复合体的再生
牙本质- 牙髓复合体是构成牙齿的主体,牙
本质- 牙髓复合体的再生是构建组织工程化牙齿
的基础,DPSCs 是极有希望的种子细胞。体外扩
增的DPSCs 接种于HA/TCP 材料后植入免疫抑制
小鼠的背侧皮下4 周,即可分化为功能性的成牙
本质细胞,在HA/TCP 材料的表面沉积牙本质;
移植后8 周形成牙本质- 牙髓样复合体的雏形,
其中的牙髓样组织由纤维结缔组织、血管和成牙
本质细胞组成;16 周形成成熟的牙本质- 牙髓复
合体。该研究表明DPSCs 移植到动物体内不仅可
分化为成牙本质细胞,形成牙本质,还能诱导宿
主细胞参与组织的再生,广州蚂蚁搬家,形成牙髓样结构。就
DPSCs 的去向而言,移植后2 周DPSCs 主要位于
HA/TCP 支架的表面或结缔组织中。到第8 周
DPSCs 除分化为成牙本质细胞外,结缔组织中
DPSCs 的数量并无明显减少,说明DPSCs 通过自
我更新,在组织中保持了数量的稳定。DPSCs 形
成牙本质- 牙髓复合体与支架材料的化学组成和
空间结构有关。将DPSCs 与经酸蚀的牙本质复
合,植入免疫抑制小鼠的皮下,只形成修复性牙
本质样结构,无牙髓样组织的生成[19]。而另一项研
究发现, 磷酸钙和钛两种材料的三维支架对
DPSCs 的成牙本质性能具有同样的效果[20]。
4 展望
由于DPSCs 缺乏特异性的表面标记,如何有
效分离和纯化DPSCs 尚在探索中。另外,DPSCs
在体外的大量扩增也较为困难。其他一些干细
胞,如BMSCs 的扩增能力和可塑性都很强[21]。因
此有学者尝试用非牙源性的干细胞构建组织工程
牙,他们将小鼠的胚胎干细胞、神经干细胞和
BMSCs 分别与胚胎口腔上皮体外共同培养3 d 后,
非牙源性干细胞向成牙性间充质细胞分化。将干
细胞与胚胎上皮联合植入成年小鼠肾被膜下,
10―14 d 后有牙齿样硬组织形成,BMSCs 与上皮
的复合移植物还形成了包含牙本质、牙髓、牙釉
质在内的牙齿样结构[22]。这说明非牙源性干细胞
在成牙信号诱导下能横向分化形成牙齿样结构。
最近有学者报道,在人牙周膜中也存在间充质干细
胞―――牙周韧带干细胞( periodontal ligament stem
cells,PDLSC),体外扩增的PDLSC 与HA/TCP支
架复合移植到免疫抑制小鼠皮下,可形成牙骨
质- 牙周膜样结构[4]。这些令人振奋的研究结果初
步展示了构建组织工程牙的美好前景。可以相
信,随着干细胞研究的深入,人类对组织工程种
子细胞的认识将更加全面,利用可靠的细胞来源
进行牙齿再造的愿望必将成为现实。